傳代保存時，培(pei)(pei)養基的濃度不宜(yi)過高，營養成(cheng)分(fen)不宜(yi)過于豐富，尤其(qi)是碳水(shui)化合物的濃度應(ying)在可能(neng)的范圍內盡量降低(di)(di)。培(pei)(pei)養溫(wen)度通(tong)常(chang)以稍低(di)(di)于zui適(shi)生長溫(wen)度為好。若為產酸菌(jun)種，則應(ying)在培(pei)(pei)養基中添(tian)加少量碳酸鈣(gai)。

　　一般(ban)地，大多數菌(jun)(jun)(jun)(jun)種(zhong)的保藏溫度以5℃為好，像厭(yan)氧菌(jun)(jun)(jun)(jun)、霍亂(luan)弧菌(jun)(jun)(jun)(jun)及部(bu)分病原真菌(jun)(jun)(jun)(jun)等微生物菌(jun)(jun)(jun)(jun)種(zhong)則可(ke)以使用37℃進行保存(cun)，而蕈類等大型食用菌(jun)(jun)(jun)(jun)的菌(jun)(jun)(jun)(jun)種(zhong)則可(ke)以室(shi)溫直接(jie)保存(cun)。

　　傳代(dai)培養保存法雖然(ran)簡便，但其(qi)缺(que)點也(ye)很明顯(xian)，如：①菌(jun)(jun)種管棉塞經常容(rong)易(yi)發霉；②菌(jun)(jun)株的遺(yi)傳性(xing)(xing)狀容(rong)易(yi)發生變異(yi)；③反復傳代(dai)時，菌(jun)(jun)株的病(bing)原(yuan)性(xing)(xing)、形(xing)成生理活性(xing)(xing)物(wu)質的能力以及(ji)形(xing)成孢子的能力等均有降低；④需要定期轉(zhuan)種，工(gong)作量大；⑤雜菌(jun)(jun)的污染機會較多。

　　2、液體(ti)石蠟覆蓋保存(cun)法(fa)(fa)：該法(fa)(fa)較前一(yi)種方(fang)法(fa)(fa)保存(cun)菌(jun)(jun)(jun)種的(de)時間更長，適(shi)用于(yu)霉菌(jun)(jun)(jun)、酵母菌(jun)(jun)(jun)、放線菌(jun)(jun)(jun)及(ji)需氧細菌(jun)(jun)(jun)等(deng)的(de)保存(cun)。此法(fa)(fa)可(ke)防止干燥，并通過限制(zhi)氧的(de)供給而達到削弱微(wei)生物代謝作用的(de)目的(de)。其具有方(fang)法(fa)(fa)簡便的(de)優(you)點(dian)，同時也適(shi)用于(yu)不宜(yi)冷(leng)凍干燥的(de)微(wei)生物（如產(chan)孢能力低的(de)絲狀菌(jun)(jun)(jun)）的(de)保存(cun)，而某些(xie)(xie)細菌(jun)(jun)(jun)如固氮菌(jun)(jun)(jun)、乳酸(suan)桿菌(jun)(jun)(jun)、明串(chuan)珠菌(jun)(jun)(jun)、分枝桿菌(jun)(jun)(jun)、紅螺菌(jun)(jun)(jun)及(ji)沙門氏(shi)菌(jun)(jun)(jun)等(deng)和一(yi)些(xie)(xie)真菌(jun)(jun)(jun)如卷(juan)霉菌(jun)(jun)(jun)、小(xiao)克銀漢霉、毛霉、根霉等(deng)不宜(yi)采用此法(fa)(fa)進行保存(cun)。

　　3、載體保存(cun)法：即將微生(sheng)物吸(xi)附(fu)在適(shi)當載體上進(jin)行干燥保存(cun)的(de)方法。常用的(de)有方法包括以下幾種，如

　　①土壤(rang)(rang)保(bao)存(cun)法：主(zhu)要用于能形成孢子或(huo)孢囊(nang)的(de)(de)微生物(wu)菌(jun)種的(de)(de)保(bao)藏。方法是在滅菌(jun)的(de)(de)土壤(rang)(rang)中加入菌(jun)液，立(li)即在室溫下進(jin)行干燥或(huo)使菌(jun)體(ti)繁殖后再干燥，然后冷藏或(huo)在室溫下密封保(bao)存(cun)。保(bao)存(cun)用的(de)(de)土壤(rang)(rang)原則(ze)上以(yi)肥(fei)沃的(de)(de)耕土為宜，土壤(rang)(rang)需風干、粉碎、過(guo)篩和滅菌(jun)。

　　使(shi)微(wei)生物在土壤(rang)中繁殖后進行干(gan)燥保(bao)存的(de)方法是：取適量(liang)土壤(rang)（5克）置于(yu)塞(sai)有棉塞(sai)的(de)試管(guan)中，加(jia)水(shui)或(huo)加(jia)入充分稀(xi)釋的(de)液(ye)體培養基（以含水(shui)量(liang)為(wei)土壤(rang)zui大持水(shui)量(liang)的(de)60%為(wei)宜(yi)），然后高壓(ya)滅菌。再將需保(bao)存的(de)微(wei)生物進行大量(liang)接種，培養至菌絲能用肉眼確認的(de)程度為(wei)止，移入干(gan)燥器中經短時(shi)間干(gan)燥或(huo)風干(gan)后密封，冷藏或(huo)室溫保(bao)存。

　　②砂(sha)土(tu)保存法：取清(qing)潔的(de)砂(sha)，過60目篩(shai)去掉大砂(sha)粒(li)，并用磁鐵吸去砂(sha)中(zhong)鐵屑，再用NaOH溶(rong)液、10%HCl溶(rong)液和水交替清(qing)洗數次，干(gan)(gan)燥后(hou)(hou)，置于(yu)試管(guan)或(huo)安瓶管(guan)中(zhong)保持2～3cm深，再經干(gan)(gan)熱滅菌(jun)(jun)后(hou)(hou)，加入(ru)1ml菌(jun)(jun)種培養液，經充(chong)分混勻后(hou)(hou)，放入(ru)真(zhen)空干(gan)(gan)燥器中(zhong)，*干(gan)(gan)燥后(hou)(hou)熔封保存。也可用二(er)份洗凈的(de)砂(sha)（經HCl預處(chu)理）和一份貧(pin)瘠、過篩(shai)的(de)黃土(tu)攙和后(hou)(hou)滅菌(jun)(jun)，再進行菌(jun)(jun)種保藏(zang)。

　　③硅膠保存(cun)法：以6～16目的無色硅膠代替(ti)砂子，干熱(re)滅菌后，加(jia)入菌液。加(jia)菌液時，由(you)于硅膠的吸附熱(re)常使溫度升高(gao)，因而需設(she)法加(jia)以冷卻。

　　④磁珠保存(cun)法：將(jiang)菌液浸入(ru)(ru)素燒(shao)磁珠（或多孔玻璃(li)珠）后(hou)(hou)再(zai)進行干(gan)燥保存(cun)的(de)一種方法。在(zai)螺旋口試管中裝入(ru)(ru)1/2管高的(de)硅膠（或無水CaSO4），上(shang)(shang)鋪玻璃(li)棉，再(zai)放上(shang)(shang)10～20粒(li)磁珠，經干(gan)熱滅菌后(hou)(hou)，接入(ru)(ru)菌懸液，zui后(hou)(hou)冷藏(zang)、室溫保藏(zang)或減(jian)壓干(gan)燥后(hou)(hou)密封保藏(zang)。本法對酵(jiao)母菌很有效(xiao)，特別適用于根瘤菌，可保存(cun)長(chang)達兩年半時間(jian)。

　　⑤麩(fu)皮保存法：在麩(fu)皮內加入60%的水，經滅菌后(hou)接(jie)種培養，zui后(hou)干燥保藏。

　　⑥紙片（濾紙）保(bao)存法：將(jiang)滅(mie)菌(jun)紙片浸入培養液或(huo)(huo)菌(jun)懸(xuan)液中，常壓或(huo)(huo)減壓干燥(zao)后，置(zhi)于裝有干燥(zao)劑的(de)容(rong)器內進行保(bao)存。

　　4、懸液(ye)保存(cun)法(fa)：即使(shi)微生物混懸于適當(dang)溶液(ye)中進行保存(cun)的方法(fa)。常(chang)用(yong)的有(you)，

　　①蒸(zheng)餾(liu)水(shui)保(bao)(bao)存法：適(shi)用于霉菌、酵母菌及絕大(da)部分放線(xian)菌，將其菌體懸浮于蒸(zheng)餾(liu)水(shui)中(zhong)即可在室溫下保(bao)(bao)存數年。本法應(ying)注(zhu)意避免水(shui)分的(de)蒸(zheng)發。

　　②糖液保(bao)存(cun)法：適用于酵母菌(jun)，如將其菌(jun)體懸浮于10%的(de)蔗糖溶液中，然后于冷(leng)暗處保(bao)存(cun)，可(ke)長達10年(nian)。除此之外，也可(ke)使用緩沖液或食鹽水(shui)等進行保(bao)存(cun)。

　　5、寄主(zhu)保(bao)存法：即令(ling)微(wei)生物侵(qin)入其寄主(zhu)后加以保(bao)存的(de)方法。

　　6、冷凍(dong)保存法：適用于抗凍(dong)力強的微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)。這些微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)可在(zai)其(qi)菌體細胞(bao)(bao)外(wai)遭受(shou)凍(dong)結(jie)的情況下(xia)而不(bu)受(shou)損(sun)傷(shang)，而對(dui)其(qi)它大多數微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)而言，無論在(zai)細胞(bao)(bao)外(wai)凍(dong)結(jie)還(huan)是(shi)在(zai)細胞(bao)(bao)內凍(dong)結(jie)，都會對(dui)菌體造成(cheng)損(sun)傷(shang)，因此(ci)當采(cai)用這種保藏方法時，應(ying)注意以下(xia)幾點(dian)，

　　①要選擇(ze)適于冷凍干燥的菌齡細(xi)胞；

　　②要選擇適(shi)宜(yi)的培養基，因為某些微生物對冷凍的抵(di)抗力，常隨培養基成(cheng)分的變化而顯示出巨大差異；

　　③要選(xuan)擇合適(shi)的菌(jun)液濃度，通(tong)常菌(jun)液濃度越高(gao)，生存(cun)率越高(gao)，保存(cun)期也越長；

　　④在(zai)菌液內不(bu)添(tian)加電解質（如食鹽等）；

　　⑤可在菌液內添加(jia)(jia)甘油(you)等保護劑(ji)(ji)，以(yi)防止在冷(leng)凍過程(cheng)中出現(xian)菌體(ti)大量(liang)死亡的現(xian)象。同樣，也可添加(jia)(jia)各種(zhong)糖(tang)類(lei)、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效(xiao)果的溶劑(ji)(ji)，但對(dui)有些微生物而(er)言，不加(jia)(jia)保護劑(ji)(ji)時更有效(xiao)。

　　⑥原則上應盡(jin)快(kuai)進行冷凍處(chu)理，但當加入保護劑時(shi)，可靜置一(yi)段時(shi)間后再進行處(chu)理。

　　⑦就動(dong)物(wu)細胞而(er)言，應(ying)在－20℃范(fan)圍內以(yi)1℃/min左右的(de)速度緩慢(man)降溫，此后必(bi)須(xu)盡(jin)快(kuai)降到貯藏溫度；而(er)對(dui)絕大多數微生物(wu)而(er)言，則不必(bi)如此，如結構(gou)較(jiao)為復雜的(de)原蟲則可(ke)在－35℃范(fan)圍內進行(xing)(xing)緩慢(man)降溫，而(er)噬菌體則必(bi)需采用上述的(de)二階段(duan)法進行(xing)(xing)冷凍；

　　⑧若進行長期保存，則貯藏溫度(du)越低越好(hao)；

　　⑨取(qu)用(yong)冷凍保存(cun)的(de)菌種時，應(ying)采(cai)取(qu)速融措施，即(ji)在35～40℃溫水中(zhong)輕輕振蕩使之(zhi)迅速融解。而就厭(yan)氧菌來(lai)說，則(ze)(ze)應(ying)選(xuan)擇靜置(zhi)融化的(de)措施。當(dang)冷凍菌融化后，應(ying)盡量避免再次(ci)冷凍，否則(ze)(ze)菌體(ti)的(de)存(cun)活率(lv)將顯(xian)著(zhu)下降(jiang)。

　　常用(yong)的冷凍保存(cun)法(fa)包(bao)括(kuo)：

　　①低溫(wen)(wen)冰箱保存(cun)(cun)法(fa)（－20℃、－50℃或－85℃）：低溫(wen)(wen)冷凍保存(cun)(cun)時(shi)使用(yong)螺(luo)旋(xuan)口(kou)試管較為(wei)方(fang)便，也可(ke)(ke)在棉塞試管外包裹塑料(liao)薄膜。保存(cun)(cun)時(shi)菌液加量不宜過多，有些可(ke)(ke)添加保護劑。此(ci)外，也可(ke)(ke)用(yong)φ5mm的玻璃珠(zhu)來吸附菌液，然后把玻璃珠(zhu)置于塑料(liao)容器(qi)內(nei)，再(zai)放入(ru)低溫(wen)(wen)冰箱內(nei)進行保存(cun)(cun)的。

　　②干(gan)冰保存法（－70℃左右）：即將菌種管(guan)插入干(gan)冰內，再(zai)置(zhi)于冰箱內進行冷凍保存。

　　③液氮保存法（－196℃）：是適用范圍zui廣的微(wei)生(sheng)物(wu)保存法。其(qi)操作步驟如下，

　　a、裝(zhuang)安瓶管：使用盡量(liang)濃(nong)厚的(de)(de)菌體懸浮于含(han)有(you)適當防(fang)凍劑(ji)（保存霉菌不用防(fang)凍劑(ji)）的(de)(de)滅菌溶(rong)液中，將(jiang)0.2～1ml的(de)(de)這種溶(rong)液分裝(zhuang)于安瓶中，或在裝(zhuang)有(you)分散劑(ji)的(de)(de)安瓶中直接(jie)接(jie)種，或將(jiang)菌絲體瓊脂塊直接(jie)懸浮于分散劑(ji)中。

　　b、熔封(feng)安(an)瓶管：若直(zhi)接(jie)貯(zhu)存于氣相液氮(dan)中（－150℃～－170℃）時，則不需熔封(feng)。

　　c、檢查安瓶管是(shi)否(fou)熔封(feng)良好：即在4℃下，將熔封(feng)安瓶管在適當的色(se)素(su)溶液中浸泡2～30分鐘后(hou)，觀察有無(wu)色(se)素(su)進入安瓶。

　　d、緩(huan)慢冷卻：將熔封安瓶管置于小(xiao)罐中(zhong)，然后用(yong)液氮氣以約1℃/min的速度(du)冷卻至－25℃左右，也可在－20℃～－25℃的冰箱(xiang)內緩(huan)慢冷卻30～60min。

　　e、速(su)冷(leng)：zui后浸入液氮中快速(su)冷(leng)卻至－196℃。

　　7、冷凍干燥保(bao)(bao)存(cun)法：其原理(li)是首(shou)先將微(wei)生(sheng)物(wu)冷凍，然后在(zai)減壓下利用(yong)升(sheng)華現(xian)象除去水(shui)(shui)分(fen)。事實上，從菌體(ti)中除去大(da)(da)部分(fen)水(shui)(shui)分(fen)后，細胞的(de)(de)生(sheng)理(li)活動就會停止(zhi)，因此可以(yi)達到長期維持生(sheng)命狀態(tai)的(de)(de)目(mu)的(de)(de)。該(gai)方法適用(yong)于絕大(da)(da)多數微(wei)生(sheng)物(wu)菌種（包(bao)括噬菌體(ti)和(he)立克(ke)次氏(shi)體(ti)等）的(de)(de)保(bao)(bao)存(cun)。

　　在進行冷凍干燥時，需注意以(yi)下(xia)幾個問(wen)題：

　　a、冷凍(dong)干燥前(qian)的(de)培養(yang)條件：首(shou)先檢驗菌種純度(du)(du)。一(yi)般地說(shuo)，將待保存的(de)微(wei)生(sheng)(sheng)物在營(ying)養(yang)豐富且容易增(zeng)菌的(de)培養(yang)基(ji)上進行(xing)培養(yang)為宜；菌齡以達(da)到(dao)對數生(sheng)(sheng)長期為好；若為有芽孢(bao)或孢(bao)子的(de)微(wei)生(sheng)(sheng)物，則以芽孢(bao)和孢(bao)子形成以后進行(xing)保存為好；菌液濃度(du)(du)以高為好，如細菌應達(da)到(dao)109～1010/ml。

　　b、菌株(zhu)號碼(ma)等的標(biao)記：可(ke)在(zai)(zai)安瓶外(wai)側標(biao)記或在(zai)(zai)安瓶內(nei)封入標(biao)簽。

　　c、安(an)瓶的準(zhun)備：將安(an)瓶在2%HCl中浸(jin)泡過夜(ye)，自來水沖洗(xi)3次(ci)后，蒸餾水刷凈，干(gan)燥，塞(sai)棉塞(sai)，貼標(biao)簽，干(gan)熱(re)滅(mie)(mie)菌(jun)或溫熱(re)滅(mie)(mie)菌(jun)后，60℃恒溫干(gan)燥。

　　d、添加保(bao)護劑：常用的保(bao)護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡(pu)(pu)萄(tao)糖的普通肉湯以及加7.5%葡(pu)(pu)萄(tao)糖的血清等等。

　　8、Bordelli氏法：取干(gan)凈的(de)小(xiao)試管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)（8×60mm）塞(sai)上(shang)棉(mian)塞(sai)，滅菌(jun)。用滅菌(jun)的(de)脫脂牛乳洗(xi)脫試管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)斜(xie)面上(shang)的(de)菌(jun)苔，制成濃厚菌(jun)懸液。然后用無(wu)菌(jun)吸管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)將(jiang)(jiang)(jiang)菌(jun)懸液滴入小(xiao)試管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)底(di)部(bu)。每管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)一滴，然后轉動(dong)小(xiao)試管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)使(shi)菌(jun)液分散在(zai)(zai)試管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)底(di)部(bu)的(de)壁上(shang)。標記菌(jun)名。將(jiang)(jiang)(jiang)小(xiao)試管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)裝在(zai)(zai)15×150mm的(de)試管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)中(zhong)，在(zai)(zai)大試管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)底(di)部(bu)事先裝上(shang)1.5cm高(gao)的(de)（P2O5或KOH），管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)口用帶玻璃(li)管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)的(de)橡(xiang)皮塞(sai)塞(sai)緊，蠟封(feng)。將(jiang)(jiang)(jiang)大試管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)與(yu)真空泵(beng)連(lian)通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱時，將(jiang)(jiang)(jiang)玻璃(li)管(guan)(guan)(guan)(guan)(guan)熔封(feng)，置(zhi)室溫暗處或冰箱保存。

　　儀器與材料

　　1、斜面菌種：絲狀(zhuang)真菌、酵母菌、芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌和無芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌各一支。

　　2、接種用具(ju)一套(tao)。

　　3、滅(mie)(mie)菌(jun)物(wu)品(pin)：1ml、5ml吸(xi)管(guan)(guan)，長(chang)(chang)滴管(guan)(guan)，安瓶管(guan)(guan)，9ml無(wu)菌(jun)水(shui)試管(guan)(guan)，砂土管(guan)(guan)，液體石(shi)蠟(la)，脫脂(zhi)牛乳。其中，液體石(shi)蠟(la)的處(chu)理為1.5kg/cm2壓(ya)力滅(mie)(mie)菌(jun)1小時或1kg/cm2壓(ya)力滅(mie)(mie)菌(jun)3次(ci)，每次(ci)30分鐘。接(jie)著檢查(cha)是否*無(wu)菌(jun)，即接(jie)入肉(rou)湯中檢查(cha)有無(wu)雜(za)菌(jun)生(sheng)長(chang)(chang)。zui后放在(zai)60～80℃轟烤(kao)以去除水(shui)分。脫脂(zhi)牛乳的處(chu)理為2000rpm離心10分鐘脫脂(zhi)，然后0.5kg/cm2壓(ya)力滅(mie)(mie)菌(jun)20分鐘，或間歇滅(mie)(mie)菌(jun)3次(ci)，經檢查(cha)無(wu)菌(jun)后備用(yong)。

　　4、P2O5，無(wu)水CaCl2各一瓶。

　　5、真空干燥器，真空泵。

　　方法

　　1、液(ye)(ye)體石(shi)(shi)蠟(la)(la)覆蓋法(fa)：取(qu)待(dai)保存的(de)菌種(zhong)斜面，用5ml無菌吸(xi)管(guan)向內加入滅菌石(shi)(shi)蠟(la)(la)，要求液(ye)(ye)體石(shi)(shi)蠟(la)(la)高出(chu)菌斜面1cm左右，若不夠此(ci)高度(du)，則(ze)常會引起斜面抽(chou)干(gan)現象(xiang)。

　　2、砂(sha)土管(guan)法：用1ml無菌(jun)吸管(guan)吸取0.2～0.5ml菌(jun)懸液，滴入砂(sha)土管(guan)中，充分混勻(yun)后(hou)，將砂(sha)土管(guan)放(fang)入真空干(gan)燥(zao)器內，抽(chou)干(gan)，真空干(gan)燥(zao)器內需放(fang)置(zhi)無水(shui)CaCl2。zui后(hou)，將干(gan)燥(zao)好的砂(sha)土管(guan)取出，迅速(su)于火焰(yan)上蠟(la)封管(guan)口，并在室溫下(xia)或冰(bing)箱中進行(xing)保存。

　　3、冷凍干燥(zao)保(bao)藏法：

　　①用滅(mie)菌長(chang)滴(di)管(guan)(guan)取出2滴(di)（約0.1ml）無(wu)(wu)菌脫脂牛(niu)乳，置于無(wu)(wu)菌安(an)(an)瓶(ping)管(guan)(guan)中，然后用另一支(zhi)無(wu)(wu)菌滴(di)管(guan)(guan)取出等體積的(de)濃菌液，同樣置于此安(an)(an)瓶(ping)管(guan)(guan)中，充分混勻。

　　②集中安瓶管，置于100ml燒杯(bei)中，將燒杯(bei)裝進(jin)真空冷(leng)(leng)凍(dong)干燥器的鐘罩(zhao)內，開(kai)機并開(kai)冷(leng)(leng)卻(que)水(shui)后，使(shi)菌液(ye)在－20℃溫(wen)度下迅速凍(dong)結成固體，然后抽真空使(shi)水(shui)分升華，2小時后，可以停止(zhi)冷(leng)(leng)凍(dong)并在稍高的溫(wen)度下進(jin)行干燥，直至全干為(wei)止(zhi)。

　　③zui后(hou)取出安瓶(ping)管，并將其(qi)與真空泵連接，再(zai)抽真空后(hou)，迅(xun)速將安瓶(ping)管熔封，zui后(hou)冰箱保(bao)存。

　　4、甘油(you)管(guan)保(bao)藏法：在5ml菌種保(bao)藏管(guan)中，將等體積的菌懸(xuan)液和40%的甘油(you)充分混(hun)勻后，于－20℃冰箱中保(bao)存。